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导读
年6月28日，由浙江医院牵头的一项关于mNGS应用于肺部感染诊断和治疗的前瞻性多中心研究成果在《TheJournalofmoleculardiagnostics》（IF=5.，JCRQ1区，中科院医学大类2区）期刊在线发表。
本文第一作者为周华、PaigeM.K.、赵冬冬、马强，共同通讯作者为杨尚鑫和俞云松。
该研究阐述了在浙江省12家医院应用BALFmNGS诊断肺炎的情况，并讨论了mNGS测序过程中的污染问题以及临床对mNGS结果的正确解读。本研究采集患者的BALF样本，同时开展传统微生物学检测（包括培养、染色、靶向PCR）和mNGS测序，以评估mNGS结果对肺炎诊断和治疗的临床影响。
结果发现，mNGS比传统方法鉴定出了更多的微生物（vs72），同时检出传统方法一致漏检的17种病原微生物，并且对40.3%（64/）的病例产生了积极的临床影响。在鉴别引起肺炎的苛养型和非典型微生物方面，mNGS测序尤为有效。本研究表明，BALFmNGS对提高肺炎的诊断率和更好的患者管理具有重要的临床价值。
一、研究背景
肺炎与高发病率、高死亡率以及高住院率相关，是一个全球性的健康问题。虽然放射学特征能够提示肺炎，但却无法鉴定病原体，而这是指导治疗所必需的。传统方法在准确鉴定肺炎病原体方面仍存在一定的局限性，尤其在非典型病原体、真菌或病毒感染的情况下。非典型细菌病原体，如鹦鹉热衣原体、肺炎支原体、肺炎衣原体和军团菌，呼吸道病毒以及真菌等无法通过常规方法进行培养，这无疑给肺炎的精准诊断带来了挑战。由于无法快速、准确地鉴定和区分呼吸道感染的病毒、细菌、真菌等，抗生素的过度使用仍然是一个长期存在的问题。因此，更敏感和更快速的诊断工具对于肺炎病原体的鉴定至关重要。
mNGS是一种直接从临床样本中检测所有DNA和/或RNA的无偏向性的分子方法，能够同时鉴定细菌、病毒、真菌和寄生虫。已有的一些病例报告和研究表明mNGS有助于呼吸道感染的诊断，但却没有专门的大规模临床研究证实它对肺炎的有效性。
二、研究目的
本文主要阐述了浙江省内12家医院利用BALFmNGS诊断肺炎的情况。从症状和胸部X-光片与肺炎一致的患者中采集BALF样本，并分别送往传统微生物学检测（包括培养、染色、靶向PCR）和mNGS（杭州迅敏康生物科技有限公司）。本研究旨在评估mNGS结果对肺炎诊断和治疗的临床影响。
三、研究方法
1.入组和排除标准
本研究于年1月至年12月从浙江医院牵头的多个临床中心（表1）入组例肺部感染患者。
01
纳入标准
1)患者不受年龄和性别的限制；
2)根据X-线胸片或肺部CT阳性结果以及新发咳嗽、原发咳嗽加重、痰液、发热、呼吸急促等临床表现，初步诊断为肺炎；
3)患者能耐受支气管镜检查，并收集到足够的BALF；
4)患者能阅读知情同意书，理解并愿意配合研究计划，并签署相关文件。
02
排除标准
排除呼吸道RNA病毒[包括甲型流感、乙型流感、副流感病毒1-4和呼吸道合胞病毒（RSV）]检测呈阳性的患者，这些病人被分到发热门诊，所以不进入呼吸科治疗。2.样本收集和实验室检测
所有患者均行支气管镜检查。采集BALF样本并将其等量进行传统微生物学检测和mNGS测序。对BALF样本开展的传统微生物学检测包括细菌、分枝杆菌和真菌培养、分枝杆菌的抗酸杆菌涂片染色法、诺卡氏菌的改良AFB染色法、耶氏肺孢子菌的直接荧光抗体染色法（DFA）、真菌的钙氟白染色、半乳甘露聚糖抗原试验，以及结核分枝杆菌复合体（GeneXpert、Cepheid）、肺炎支原体、肺炎衣原体和巨细胞病毒的PCR检测等。此外，研究还对血清样本进行了1,3-β-D-葡聚糖、半乳甘露聚糖和隐球菌荚膜抗原检测。
3.临床影响的确定
将mNGS产生的积极影响定义为：1）通过mNGS结果做出明确的诊断；2）由于mNGS结果导致的治疗改变，从而产生了良好的临床结果。负面影响是指根据mNGS结果做出的错误诊断，导致不必要的或不理想的治疗结果。
四、研究结果
1.患者特征
研究共纳入12家医院的例男性和57例女性患者，年龄从1~86岁不等（平均=50.3，标准差=19.1）（表1）。
所有患者的X-线胸片表现与肺部感染相一致，最常见的临床症状包括发热（67.3%）、咳嗽（61.0%）和气促（22.6%）（表1）。大约2/3的患者（/）有以下的基础疾病，其中糖尿病17例，实体瘤17例（其中肺癌13例），血液系统恶性肿瘤9例（其中6例接受干细胞移植），慢性肺部疾病27例（如支气管扩张、哮喘、慢性阻塞性肺疾病、肺纤维化、间质性肺疾病、肺结核等）。其他基础疾病包括高血压、冠心病、慢性乙型肝炎、慢性肝病和肾功能不全等。只有一名患者曾被诊断为HIV感染。一些患者有多种潜在基础疾病。大多数患者（/，96.2%）治愈（80/，50.3%）或临床好转（74/，46.5%）。3名患者未获得临床改善，2名患者死于合并症。
2.mNGS质量概述
平均每个样本获得了14,,条reads（75bp）（最小=2,,，最大=54,,，中位数=12,,）。大多数样本（/，95.6%）的reads数高于5M，66.0%（/）的样本超过10M。大约一半（78/）的样本reads数在10-20M，86.2%（/）的样本reads数在5-25M。去除人源序列后后，71.1%（/）的样本中非人源序列小于10%。非人源序列百分比的中位数为1.78（最小=0.56，最大=97.24），表明大多数样本含有较高比例的宿主DNA。
mNGS检测到的最常见的正常菌群包括表皮葡萄球菌和产黑素普雷沃菌，本研究在大约一半的样本中检测到这两种细菌。其他常见的正常菌群包括凝固酶阴性葡萄球菌属、链球菌属、普雷沃特氏菌属、棒状杆菌属、核梭杆菌、细长奈瑟氏菌、牙龈卟啉单胞菌、微小小单胞菌和许多其他在口腔中常见的细菌。这些正常的菌群物种大多被过滤掉，只有当它们的reads数高于软件内置的特定阈值时才会报告。排名前十的污染微生物依次为痤疮皮肤杆菌、温氏支原体、睾丸酮丛毛单胞菌、约翰森不动杆菌、嗜酸杆菌属、鹤羽田戴尔福特菌、弯曲假单胞菌、荧光假单胞菌、奥斯陆莫拉氏菌和水管致黑栖热菌。
为保证mNGS结果的有效性，本研究采用了以下几种质控措施：
01
质控措施
每次mNGS测序均设阴性对照，以检测背景微生物DNA污染物，仅当reads数超过阴性对照中相应reads数的10倍时，真阳性结果才有效；
02
质控措施
为了避免交叉污染或“溢出”造成的假阳性结果，只有当同一样品中某一物种的reads数超过样品中同一物种在同一批次所有样品中同一物种总reads数的10%时，真阳性结果才有效；
03
质控措施
内部对照（内参）（在每个样品中添加一种独特的海洋细菌）应检测到条以上的reads数，以保证阴性结果有效；
04
质控措施
过去次阴性对照中出现频率高于10%的“环境”物种（由IngeniSeq-MGv1.0mNGS软件预先确定）考虑为污染微生物，将从最终结果中过滤掉；
05
质控措施
如果“正常菌群”的reads数低于软件内的特定阈值，则“正常菌群”（通常在人体呼吸道中定植，由IngeniSeq-MGv1.0mNGS软件预先确定）也会被当作污染微生物过滤掉。过滤正常菌群的特定阈值是通过对+个BALF样本（迅敏康专有数据）的宏数据分析确定的。
3.mNGS与传统方法的检测结果比较
mNGS与传统结果完全一致的有85例（53.5%），包括阴性67例，阳性18例。在例患者中，通过传统方法未检出微生物的有例，而mNGS在每个样本中鉴定出以下数量的特定微生物：1种微生物（22例）、2种微生物（6例）或3+种微生物（6例）（表2）。相反，83例患者的mNGS结果为阴性，但传统方法在这些病例中鉴定出1种微生物（14例）、2种微生物（1例）或3+种微生物（1例）（表2）。
总体而言，mNGS比传统方法鉴定出更多的细菌（89vs54）、真菌（18vs15）和病毒（10vs3）（图1）。仅通过mNGS和仅通过传统方法分别鉴定了17种和4种微生物（图2）。已知可引起肺炎且仅通过mNGS检出的细菌包括鹦鹉热衣原体、流感嗜血杆菌、嗜肺军团菌、脓肿分枝杆菌、禽分枝杆菌和放线菌属等。此外，mNGS还检出了未包括在传统病原学检测中的水痘-带状疱疹病毒（1例）和腺病毒（3例）（图2）。
4种微生物仅通过传统方法鉴定出，包括脑膜炎败血症伊丽莎白金菌、斯氏普罗威登斯菌、科氏葡萄球菌、隐球菌（图2）。但本研究仅将隐球菌考虑为致病菌，然而该菌仅仅是通过血清抗原试验在血液标本中检测到。mNGS漏检的可能原因包括：1）BALF样品中的微生物载量极低，低于mNGS的检测限，或者分析软件错误地将该物种作为正常定植菌群或环境污染微生物过滤掉了。
在mNGS阳性而传统方法为阴性的患者样本中，检出最常见的微生物为耶氏肺孢子菌（8例）、肺炎支原体（5例），肺炎链球菌（4例），铜绿假单胞菌（4例），肺炎克雷伯菌（3例）以及中间型消化链球菌（3例）。
4.mNGS结果对诊断和治疗的临床影响
虽然部分诊断依赖于影像学，但基于mNGS、传统方法以及mNGS结合传统方法的结果分别应用于36例（22.6%），39例（24.5%）和28例（24.5%）患者的最终诊断（图3）。
mNGS结果分别对64例（40.3%）和94例（59.1%）患者产生了积极的影响或无影响，仅对1例患者（0.6%）产生了负面影响（表3）。在产生积极影响的病例中，mNGS阳性结果有助于45例患者的明确诊断，mNGS阴性结果有助于排除19例活动性感染。在无影响的94例患者中，86例患者的mNGS结果显示未检测到任何额外的病原体，8例患者的mNGS结果被认为是污染物或无意义（表3）。
在患者管理方面，mNGS结果直接导致积极影响中的59例患者治疗方案的改变（59/64），或有助于5例确诊患者继续开展经验性治疗（5/64）。在因mNGS结果而改变治疗的59例病例中，有40例调整为抗生素的降级（停止使用抗生素或调整为更窄的抗生素谱）。在64例有积极影响的病例中，63例均已治愈或好转。在另一个病例中，根据mNGS结果诊断为由巨细胞病毒和诺卡氏菌引起的肺炎，尽管进行了适当的治疗，但患者最终还是死于合并症。特别需要指出的是，mNGS在9例病例中发现了需要不同靶向治疗的多类型病原体的混合感染（表4），包括分枝杆菌（例如结核分枝杆菌、禽分支杆菌）、非典型细菌（例如军团菌、诺卡氏菌）、常见细菌（例如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌）、真菌（例如曲霉、耶氏肺孢子菌）和病毒（例如巨细胞病毒），这体现了某些肺炎患者的复杂病因以及mNGS在一次检测中鉴定出全部病原体的优势。
五、讨论
本文主要介绍了国内多家医疗机构利用BALFmNGS进行肺炎诊断和治疗的临床应用。研究强调了mNGS能够对呼吸道病原体进行物种级别的鉴定，为临床诊断或补充传统结果的提供重要信息。总体而言，mNGS在64例（40.3%）病例中产生了积极影响，包括明确诊断和识别其他病原体，并在患者临床症状改善和缺乏活动性感染迹象时为抗生素的降级提供直接依据。
由于mNGS的无偏向性和广谱的微生物检测，使得无法对定植以及污染的微生物进行区分。对于病原菌载量较低的标本，背景污染和定植菌尤其令人担忧。mNGS技术目前还没有标准的方法来区分污染、定植和真正的病原体。为了尽量避免污染的发生，样本制备和测序过程的每一个步骤都应包括阴性对照，并建立严格的生物信息学阈值，以过滤掉实验室的污染并减少高阳性样本的批次内溢出（交叉污染的来源）。
对于mNGS结果，临床医生应根据临床表现和同时开展的实验室结果（包括细菌和真菌培养、直接涂片染色、组织学和血清学）进行评估。然而，当金标准的结果与mNGS结果相冲突时，对于结果的正确解读则有一定的困难。在本研究中，临床医生依据临床判断来决定是否对金标准结果或mNGS结果采取行动，或两者兼而有之。
代表样本来源区域活跃的或死亡的微生物产生的瞬时微生物DNA也可能混淆mNGS结果。因此当检测到很多微生物物种时，对mNGS结果的解释更应谨慎。呼吸道病原体通常表现出不同的耐药性模式，尽管通过mNGS测序可提供一些药敏信息，但培养仍然是扩大药敏试验所必需的。
六、结论
综上所述，这项大规模前瞻性多中心临床研究全面评估了mNGS在肺炎诊断中的临床应用价值，结果表明mNGS对于提高肺炎的诊断水平和促进更好的患者管理方面具有显著的临床价值。
参考文献：
ZhouH,LarkinPMK,ZhaoD,etal.,ClinicalImpactofMetagenomicNext-generationSequencingofBronchoalveolarLavageintheDiagnosisandManagementofPneumonia:AMulticenterProspectiveObservationalStudy.JMolDiagn.Jun28:S5-（21）-1.
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